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細胞培養(yǎng)三步驟——復蘇、傳代、凍存

來源：廣州虹科電子科技有限公司 2025年06月21日 12:03 3

細胞培養(yǎng)是指在體外模擬生物體內(nèi)環(huán)境（無菌、適宜溫度、酸堿度和一定營養(yǎng)條件等），使之生存、生長、繁殖并維持主要結構和功能的一種方法。細胞培養(yǎng)也叫細胞克隆技術，是細胞生物學研究方法中重要和常用技術，通過細胞培養(yǎng)既可以獲得大量細胞，又可以借此研究細胞的信號轉(zhuǎn)導、細胞的合成代謝、細胞的生長增殖等。

細胞培養(yǎng)的具體步驟可分為：細胞復蘇、細胞傳代、細胞凍存

一、細胞復蘇

細胞復蘇的原則：快速融化

在復蘇細胞時必須遵循快速融化的原則，即必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至 37 ℃，因為這樣可使凍存時細胞外的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶，對細胞造成損害。

細胞復蘇操作過程

二、細胞傳代

細胞傳代中遇到的問題及解決方案：

傳代密度過高：一旦細胞養(yǎng)太久至融合度過高（>90%）才傳代，容易使細胞產(chǎn)生老化現(xiàn)象，甚至是堆疊，再消化細胞時不易吹打成單顆細胞，即便再重新鋪盤傳代，細胞也無法回到原本的特性了。（如：單層細胞，沒長滿就發(fā)生堆疊現(xiàn)象）

解決方案：盡量避免融合度過高，鏡下觀察融合度約達到80%即可傳代分盤。

傳代密度低：哺乳動物貼壁培養(yǎng)細胞，若細胞培養(yǎng)到80-90%密度需要開始傳代，在傳代接種細胞密度過低，細胞間距離太遠，就無法在細胞間產(chǎn)生黏附及通信作用，幫助信號傳導并活化細胞；總體細胞量不足，分泌的生長因子濃度會不足以產(chǎn)生利于生長的微環(huán)境，以上皆會造成增殖速度遲緩或細胞死亡。

解決方案：細胞傳代時，要進行準確的細胞計數(shù)，確保鋪盤的密度。

細胞傳代操作過程：

三、細胞凍存

細胞凍存的基本原理：慢凍

手動降溫：將細胞依序放在4℃（30分鐘）、-20℃（1小時）、-80℃（過夜）后移至液氮中保存。
程序降溫盒：是一般泛使用的降溫法，為一種特制冷凍容器（填充異丙醇或依靠特制金屬導熱），使細胞以每分鐘約-1℃的速度降至-80℃（過夜），然后移至液氮中保存。
免液氮程序降溫儀：一種新型自動化程序降溫方法，通過微處理器精確控制冷卻速率和樣品溫度，能夠控制樣品線性/非線性降溫，能夠有效減少凍融過程對于細胞或組織的傷害，重現(xiàn)性好，降溫過程可控，成本低。（例如點成生物CRF-1免液氮程序降溫儀）

細胞凍存操作過程：

點成生物產(chǎn)品推薦：CRF-1程序降溫儀

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